Rigor Mortis - buněčné linie, protilátky a statistika

18. 4. 2019 / Boris Cvek

Tématem jsou tzv. buněčné linie, jejichž výzkum tvoří obrovskou část biomedicíny. Běžně se lze setkat s tvrzením, že nějaká látka vykazuje protinádorovou aktivitu proti rakovině, kupříkladu, prsu, přičemž se tím myslí, že tato látka je schopna efektivně zabíjet buněčné linie rakoviny prsu ve zkumavce. To samé by se dalo říci bezesporu také o kyselině sírové. Ale to je teď vedlejší. Co jsou to buněčné linie? Rakovinné buňky mají tu vlastnost, že se neustále množí. Když se vám podaří je izolovat z nějakého onkologicky nemocného pacienta, můžete je pěstovat uměle ve zkumavce prakticky donekonečna. První známou buněčnou linií jsou tzv. HeLa buňky, které byly izolovány z nádoru děložního čípku jedné pacientky (Henrietty Lacks) v USA, která zemřela v 50. letech.

Její nádor žije v této podobě dnes všude po světě v laboratořích a v součtu bude jistě přesahovat hmotnost původní pacientky samotné. Ty buňky jsou stále množeny v inkubátorech, aby bylo možné na nich dělat experimenty. Problém je, že za desítky let života v laboratorních podmínkách tyto tzv. buněčné linie (např. HeLa je jedna z nich) nemusejí mít s původním nádorem mnoho společného, dokonce se buňky téže linie mohou navzájem lišit ve svém genomu mezi různými laboratořemi (o tom se zmíním podrobněji níže). Kromě HeLa buněk existují další stovky buněčných linií, dokonce i takových, které nejsou odvozeny od rakoviny, ale od jiných, tentokrát zdravých stále se dělících buněk, třeba buněk předkožky.

Harris začíná pátou kapitolu příběhem Niny Desai z Ohio State University, jejíž tým v jedné publikaci tvrdil, že dokáže izolovat buněčnou linii z lidské dělohy, takže tyto buňky se mohou nekonečně dělit a mohou také produkovat růstové faktory pro lidská embrya a najít tak uplatnění v umělém oplodnění. To se vskutku stalo: mezi lety 2004 a 2007 byly tyto buňky použity při péči o embrya 316 žen. Výsledkem bylo 111 dětí, které se zdravě narodily 76 matkám.

Zde Harris dělá exkurz k HeLa buňkám, zmiňuje se o jejich vzniku a zejména jejich schopnosti kontaminovat jiné buněčné linie. Když nejste při laboratorní práci s buněčnými liniemi dostatečně opatrní, může se vám stát, že vám HeLa buňky kontaminují jinou buněčnou linii a po čase v této buněčné linii budete mít už jen HeLa buňky (ty původní vymřou), i když budete přesvědčeni, že to jsou stále tytéž buňky (buněčné linie nelze od sebe rozeznat při běžném mikroskopování). Harris připomíná, že tento problém je dobře popsán už od 60., kdy Walter Nelson-Rees testoval různé buněčné linie a zjistil, že to jsou často ve skutečnosti HeLa buňky. Představte si, že máte buněčnou linii, odvozenou od nádoru prsu, ale někdo ji kdysi kontaminoval HeLa buňkami a od té doby jsou tam už jen ony, ačkoli vy si pořád myslíte, že pracujete s buněčnou linií nádoru prsu. Tohle je nesmírně rozšířený problém a je popsaný už padesát let.

V roce 1986 Michael Gold publikoval knihu „Conspiracy of Cells“ („Spiknutí buněk“), v níž popisuje zjištění Nelsona-Reese. Harris píše: jak vědci odpověděli na tato zjištění o buněčných liniích, které používali? Odpovídá si lapidárně: Většinou tento problém ignorovali. Harris uvádí konkrétní případy. Buněčná linie KB, která se široce používá pro výzkum rakoviny dutiny ústní? Ve skutečnosti jde o HeLa buňky. Buněčná linie HEp-2, považovaná za rakovinu hlasivek? Jde opět o HeLa buňky. Více než sedm tisíc publikovaných prací použilo HEp-2 buňky nebo Int-407 buňky, aniž by jejich autoři reflektovali, že jde ve skutečnosti o HeLa buňky. Odhadované náklady: více než 700 milionů dolarů. Podle studie z roku 2007 se odhaduje, že až 36% všech experimentů s buňkami používá špatně určené buněčné linie. Náklady se pohybují v miliardách dolarů. Dnes je poměrně snadné přesně identifikovat, o jaké buňky v dané linii vlastně jde. Podle seznamu z roku 2016 vypracovaného organizací Cell Line Authentication Commitee se (zatím) jedná o 438 buněčných linií, které ve skutečnosti nejsou tím, za co se vydávají. Harris líčí podrobně příběh buněčné linie MDA-MB-435, která byla široce uznávanou buněčnou linií nádoru prsu, ale ukázalo se, že jde o buněčnou linii melanomu.

A zde se Harris vrací k buňkám Niny Desai, oněm buňkám, využívaným při umělém oplodnění. Ukázalo se, že jde o, jak jinak, HeLa buňky. Pokud by se technika používání těchto buněk při umělém oplodnění dodržovala precizně podle návodu, neměl by to být žádný problém, ačkoli samozřejmě kdyby se vědělo, že jde o HeLa buňky, nikdy by je nikdo neschválil pro takové použití. Následky těchto zjištění jsou, jak Harris píše, zatím nejasné.

Přeskočím Harrisovo líčení problémů, spojených s buněčnými liniemi, odvozenými od nádoru mozku, zvaného glioblastom. Harris se totiž dostává k mnohem zásadnější otázce: nakolik jsou vlastně experimenty s buněčnými liniemi vypovídající o reálné nemoci? Buněčné linie, pěstované v laboratoři, typicky rostou v jedné vrstvě (reálné nádory jsou trojrozměrné), a daří se jim v prostředí, které ani nepřipomíná nádor např. co do množství dostupného kyslíku. Tyto buňky také rostou mnohem rychleji než reálný nádor. Harris cituje vědce Gottesmana: „Někteří lidé říkají, že HeLa buňky jsou nový biologický druh.“ To celkem vystihuje můj dlouhodobý názor, že buněčné linie obecně jsou umělý výtvor výzkumníků. Na konci 80. let Národní ústav pro výzkum rakoviny (NCI) v USA stanovil panel 60 vybraných buněčných linií, které měly sloužit k nalezení látek, jež by mohly, na základě své toxicity pro tyto linie, sloužit jako kandidátky pro léčení onkologických pacientů. Ukázalo se, že tento přístup selhává.

Podle Gottesmana jediný lék, který se takto podařilo vyvinout, je lék Velcade, používaný proti mnohočetnému myelomu. K tomu dodávám, že Velcade (aktivní látkou je bortezomib), jehož příběhem se shodou okolností dlouhodobě zabývám, je ve zkumavce schopen zabíjet celou škálu různých buněčných linií. První klinický test bortezomibu také zahrnoval pacienty s rozmanitými rakovinami. Jen shodou okolností mezi nimi byla i pacientka s mnohočetným myelomem, a ta byla „zázračně uzdravena“. To zaměřilo pozornost vědců tímto nečekaným směrem. Náhoda. Od té doby bylo provedeno mnoho klinických testů bortezomibu u pacientů s jinými nádory. Prakticky všechny selhaly. Nikdo na základě experimentů s buněčnými liniemi nepredikoval, že by bortezomib mohl být účinný jen proti mnohočetnému myelomu – a jeho selhání v jiných nádorech je diskutovanou otázkou dodnes (více lze nalézt v článku Škrott & Cvek: Critical Reviews in Oncology/Hematology 2014). Mezitím NCI svou baterii 60 buněčných linií zrušil.

K užitečnosti buněčných linií jako modelů pro výzkum rakoviny bych ještě rád zmínil následující, dnes dobře známý, fakt. Jedná se o tzv. heterogenitu nádorů. Rakovinné buňky se vyznačují tím, že nemají stabilní genom. To znamená, že během jejich množení dochází k tomu, že když z buňky s nějakými geny vzniknou nové buňky, ty nemusí mít stejné geny jako původní buňka. Tak se stává, že v reálném pacientovi se jeden a týž tumor skládá z buněk s různým genomem. V případě, že tyto buňky jsou pěstovány po desítky let v laboratořích, není překvapivé, že se mohou od sebe navzájem lišit v genomech. A tím spíše se budou lišit od původního nádoru, z něhož byly izolovány. Tak jako tak, heterogenita genomu v rámci jednoho nádoru v pacientovi naznačuje, že sofistikované metody, zaměřené na jednu mutaci, nemusí být účinné (a většinou skutečně nejsou). Zdá se naopak, že účinné léky proti rakovině, jako např. Cisplatina nebo bortezomib, útočí na buňky nespecificky, tedy „brutálním zásahem“ ovlivňují celou řadu dějů v buňce. Bohužel tyto nespecifické zásahy jsou toxické i pro zdravé buňky. Ale pokud zasahujete specificky jednu mutaci v nádorové buňce, je pravděpodobné, že v nádoru budou nebo během buněčného dělení vzniknou buňky rezistentní na tento zásah, právě kvůli nestabilitě genomu, typickému pro nádorové buňky. Nejde o nic jiného než od darwinistickou evoluci na velmi krátké časové škále (podobně jako při vzniku rezistence na antibiotika u bakterií, které také umí měnit svůj genom velmi rychle).

V dalším pokračování páté kapitoly Harris opouští tematiku buněčných linií a přechází k dalšímu příbuznému tématu, totiž protilátkám. To jsou molekuly, jež se dokážou vázat specificky na danou bílkovinu, takže je pomocí nich možné např. lokalizovat onu bílkovinu v buňce či tkáni. Navážete na protilátku něco, co se zbarví v nějakém konkrétním světle (většinou ultrafialovém) třeba červeně, a když posvítíte tímto světlem na buňku, do níž jste dali onu protilátku, rozsvítí se ta místa, kde je bílkovina vašeho zájmu, červeně. Problém je, že protilátky často selhávají. Harris líčí mj. i příběh tzv. irisinu. Podle objevu, který učinili vědci na Harvardově univerzitě v roce 2012, měl být irisin hormon, který převádí normální tuk v těle na tzv. hnědý tuk, jenž aktivně spaluje kalorie a může tedy hrát roli v hubnutí. To vedlo k obrovskému zájmu o irisin ve vědecké komunitě a komerční firmy začaly nabízet protilátky specifické pro irisin. Tyto protilátky se pak používaly ve výzkumu, který měl ukázat, zda cvičení, strava nebo dokonce turecké lázně mohou vést k hubnutí.

Další experimenty nicméně vedly k vážným pochybnostem, zda irisin vůbec existuje. Ukázalo se, že pokud existuje, tak jeho množství v krvi je tak malé, že protilátkami by mělo být stěží určitelné. Důsledkem bylo značné ochlazení aktivity vědců v této oblasti výzkumu. V každém případě vzniká podezření, že lze masivně prodávat protilátky, pokud jde o atraktivní téma, které nemohou k ničemu sloužit. Pokud vědci viděli (a dokonce publikovali) nějaké výsledky při práci s těmito protilátkami, studovali ve skutečnosti zřejmě úplně jiné bílkoviny, než je irisin.

Harris líčí další úsilí vědců identifikovat protilátky, které ve skutečnosti nefungují. Jedna firma, Abgent, po důkladné revizi 18 tisíc protilátek, které nabízela, musela několik tisíc z nich stáhnout z prodeje. Táž firma také výrazně zpomalila uvádění nových protilátek na trh, z původních 4-5 tisíc ročně na tisíc ročně. Jiná firma, Abcam, největší v této oblasti podnikání, začala zkoumat své protilátky pomocí nejmodernější technologie, přičemž ty protilátky, které svítily v buňkách, v nichž nebyla bílkovina, na kterou se měly specificky vázat, začala vyřazovat. Je jasné, že pokud chcete sledovat nějakou konkrétní bílkovinu a věříte, že protilátka, kterou používáte, bude vázána jen tam, kde tato bílkovina je, může pro vás mít katastrofální důsledky, když se protilátka bude vázat také na jiné bílkoviny. Abcam chce takto testovat asi 500 protilátek ročně a podle Harrise tímto testem podle oficiálního sdělení firmy prošlo úspěšně 60-70% dosud testovaných protilátek. Abcam prodává přes 100 tisíc produktů, většinou protilátek.

Šestá kapitola nese titulek „Jumping to Conclusions“, což lze v kontextu přeložit jako „Zbrklé závěry“. Na začátku se setkáváme s objevem, který měl výrazný ohlas v americkém Kongresu. Kongres v roce 2002 schválil v této věci dokonce rezoluci, požadující více peněz na další výzkum. Tehdy vědci z FDA (v USA úřad pro schvalování a kontrolu léků a potravin) a NIH (Národní ústavy zdraví v USA) ohlásili, že vytvořili novou metodu pro detekci rakoviny vaječníků. To by mohlo pomoci najít u pacientek tuto nemoc dříve, než bylo dosud možné, a tedy zachránit mnoho životů. Následoval poprask v médiích a nadšení u mnoha vědců. Zdálo se, že tuto metodu by bylo možné použít také u jiných rakovin. V čem tato metoda spočívala? Vědci vezmou bílkoviny z krve a dají je do přístroje, který umožňuje tyto bílkoviny roztřídit podle jejich hmotnosti. Onen původní výzkum, který vzbudil tolik pozornosti, ukázal, že když vědci srovnali tyto výsledky u 50 žen s rakovinou vaječníků a u 50 zdravých žen, byl mezi nimi jasný rozdíl. Tento rozdíl měl být využit podle jednoduché logiky: v případě, že se výsledek takového měření u dané pacientky podobá tomu prvnímu vzorku, je vážné podezření, že má rakovinu vaječníků, a naopak. Inovace tohoto přístupu tkví v tom, že místo hledání jedné bílkoviny, která signalizuje, že pacientka má rakovinu vaječníků, vědci sledovali celé spektrum bílkovin a rozdíl v tom, jak takové spektrum vypadá u pacientek s rakovinou vaječníků v porovnání se zdravými ženami.

Brzy se ale objevily vážné pochybnosti. Problém byl v tom, že data pro první skupinu, tedy pro ženy s rakovinou, byla měřena v jiný den než data pro zdravé ženy. A měřicí přístroje mají obecně tu vlastnost, že generují tzv. šum. Šum neodpovídá ničemu v měřeném vzorku, je to prostě něco, co vytváří sám přístroj. V různé dny může šum toho samého přístroje vypadat jinak. A právě rozdíl mezi oběma skupinami byl ve skutečnosti rozdíl v šumu. Není to nic nového, jedná se o dobře známý tzv. „batch effect“, tedy rozdíl mezi skupinami dat, který je daný jen procesem měření, nikoli realitou vzorků samotných. Ačkoli prestižní lékařský časopis Lancet, který zveřejnil původní výzkum o nové možnosti detekce rakoviny vaječníků, neměl podle Harrise zájem publikovat tato devastující zjištění, příležitosti se chopil New York Times. FDA tehdy tehdy zarazila firmu Correlogic, která prodávala produkt OvaCheck, jenž měl právě na základě krevních testů, postavených na oné studii z Lancetu, umožnit včasnou detekci rakoviny vaječníků. FDA chtěla, aby Correlogic demonstrovala účinnost takového testu. Přes veškeré snahy se to firmě Correlogic nepodařilo. V roce 2010 Correlogic zbankrotovala a název OvaCheck je používán dnes pro naprosto jiný komerční test.

A tím se Harris dostává k obecnému problému s analýzou dat. Odhaduje se, že v biomedicíně asi každý čtvrtý nezopakovatelný výsledek výzkumu je nezopakovatelný právě kvůli chybné analýze dat. Obor, který se věnuje této problematice, se nazývá biostatistika. Harris tvrdí, že vědci v biomedicíně nejsou v této oblasti dostatečně vzděláni a nejsou připravení řešit problémy tohoto typu, ačkoli by stačilo obrátit se na profesionální biostatitisky. Jako další výmluvný příklad batch efektu zmiňuje studii z roku 2007, publikovanou v Nature Genetics. Autoři této studie se věnovali sledování aktivních genů mezi asiaty a bělochy, přičemž zjistili, že aktivita genů mezi oběma populacemi se významně lišila. Ukázalo se, že data populace bělochů byla měřena v letech 2003-2004, zatímco data populace asiatů v letech 2005-2006. V roce 2010 pak vyšel článek v Nature Reviews Genetics od vědců, kteří upozornili na selhání onoho článku o asiatech a běloších, a tento článek obecněji poukázal na to, že problém batch efektu je v biomedicíně značně rozšířený. Pro klinickou praxi to může mít vážné důsledky. Problém je v tom, jak upozorňuje Harris, že vědci potřebují ze změti dat dostat něco atraktivního, k čemuž může rozdíl v šumech sloužit velmi efektivně.

Biomedicína se (nejen) v produkci dat velmi rychle mění. Před třiceti lety bylo malým zázrakem, tvrdí Harris, vytvořit 50 bodů dat v genetice za několik týdnů, dnes umí vědci vytvořit 50 milionů bodů během jednoho dopoledne. Velké soubory dat jsou základem moderních odvětví biologie, jako je genomika, proteomika, metabolomika, transkriptomika a další „omiky“. Harris se pak věnuje povšechně osudu genomiky: mnohokrát již bylo zveřejněno senzační zjištění, že vědci pomocí analýzy velkých dat o genech určili, jaké geny mohou za různé nemoci, např. schizofrenii, depresi, nemoci srdce. Většinou šlo omyly. Slavný se v tomto ohledu stal výzkum Johna Ioannidise ze Stanfordovy univerzity. Podle jeho zjištění pouze jedno procento článků, jež podrobil statistické analýze, obstálo. Zbytek, tedy 99%, jsou články, které lze označit za „falešně pozitivní“ (tedy tvrdící, že existuje něco, co ve skutečnosti nebylo prokázáno). Od té doby, podle Ioannidise, se situace výrazně zlepšila. Nicméně „substandardní“ genomika dosud kvete v Číně, odkud pochází, jak tvrdí Ioannidis, asi 70% všech falešně pozitivních publikací.

Harris se pak obecně věnuje pojmu „statistické významnosti“. Konvenčně – ale chybně – se tento pojem chápe tak, že lze prokázat, že daný výsledek výzkumu je s alespoň 95% pravděpodobností správný. To je formulováno jako tzv. p-hodnota 0,05 (0,05 je 5%, tedy pravděpodobnost, že výsledek není správný, je 5%). Hodnota p rovná nebo menší než 0,05 je obecně vnímaná jako nutná podmínka publikovatelnosti výsledků. Harris se věnuje poměrně podrobně historii vzniku této pověry. Já se omezím na oficiální stanovisko Americké statistické organizace (citované Harrisem): p-hodnoty nemohou být mírou pravdivosti hypotézy nebo mírou pravděpodobnosti nahodilosti naměřených dat. Stejně tak to, že nějaký výsledek je statisticky významný, neznamená, že je hodnotný. S velkou mírou statistické významnosti lze měřit zcela bezvýznamné banality. Podle ekonoma Uriho Simonsohna z Pennsylvánské univerzity existuje mnoho způsobů, jak vědci přizpůsobují data svým potřebám, a to dokonce téměř nevědomě. Stačí, když se dívají na data očima své hypotézy a uvidí tam jen to, co ji potvrzuje. Jiná možnost spočívá v tom, že vědec sleduje generování dat a zastaví tento proces v okamžiku, kdy dosáhnou statistické významnosti. Možná kdyby se měřilo dál, ukázal by se opak jeho hypotézy. Tuto praxi nazývá Simonsohn „p-hacking“. Podle jeho slov ji provozuje téměř každý.

Jiný vážný a široce rozšířený problém je podle Simonsohna přizpůsobování hypotézy datům. Podle statistických pravidel by to mělo být tak, že nejprve formulujete svou hypotézu a teprve pak měříte data, která pak už nemůžete interpretovat ve světle hypotézy zcela jiné, která se vám zdá, na rozdíl od té původní, z naměřených dat plynout. Lze to vysvětlit na tomto příkladu (tzv. klam texaského ostrostřelce): nějaký člověk jde kolem terče a obdivuje trefy přímo do jeho středu. Objeví se kluk a tvrdí, že tím ostrostřelcem je on. Na obdivnou otázku, jak toho dosáhl, odpoví chlapec nevinně: „Dosáhl jsem toho velmi snadno. Nejprve jsem střílel a terč jsem pak domaloval.“ Tomuto přístupu se ve vědě říká HARKing (vytváření hypotéz poté, co jsou známy výsledky měření). HARKing je problém, který se objevuje, když se zaměňuje počáteční stádium výzkumu, kdy jde o formulování hypotéz, se stádiem výzkumu, kdy se mají hypotézy potvrdit.

V počátečním stádiu je samozřejmě naprosto v pořádku generovat hypotézy podle známých dat, tyto hypotézy ale nemohou být potvrzovány zpětnou interpretací již naměřených dat. Je to dlouho známý problém, popisovaný už v 50. letech. Nicméně potřeba přicházet s převratnými objevy vytváří velký tlak na interpretování prvního stádia výzkumu jako potvrzení dané hypotézy, generované ex post. Proto se mnohá převratná zjištění, hlásaná médii, v dalších zkoumáních nepotvrzují. Spousta vědců, kteří provozují HARKing, si nejsou vědomi, že dělají něco špatně, a to navzdory tomu, že problém je popsaný už desítky let.

Někdy se to stává ovšem zcela záměrně, a to typicky při vývoji nových léků. Existuje, jak Harris píše, silný komerční tlak na nasvícení dat ohledně vlastností dané látky, která má být lékem, tak, aby to bylo statisticky co nejpřesvědčivější pro úřad, jenž schvaluje nové léky (v USA je to FDA). Příkladem, který Harris cituje, je lék Vioxx, který byl používán proti artritidě. Tento lék byl poté, co byl v roce 1999 schválen, bestsellerem. Ačkoli jeho výrobce, firma Merck, věděl o zvýšeném riziku infarktu, který tento lék vykazoval v klinických testech, argument Mercku byl jednoduchý: pacienti v kontrolní skupině měli ve skutečnosti abnormálně nízký výskyt infarktů, tedy pacienti léčení Vioxxem, kteří měli vyšší výskyt infarktů než kontrolní skupina, měli riziko infarktu jako normální populace. Při takové interpretaci dat je jasné, že Vioxx riziko infarktu nezvyšuje. Tento argument ale nakonec neobstál. Vioxx byl stažený z trhu stejně jako desítky dalších léků, jež původně prošly právě pomocí manipulace se statistikou.

Problém je, že původní data, na jejichž základě firmy stavějí své argumenty v rámci schvalování nových léků, nejsou zpravidla veřejná. Příkladem, který uvádí Harris, je žaloba, již podala jedna organizace, hájící pacienty s AIDS, na FDA. FDA měl podle této žaloby zveřejnit původní analýzu dat, týkající se léku Truvada. Společnost Gilead Pharmaceuticals, která tato data vlastní, se bránila tím, že zveřejnění analytických metod ji může poškodit v konkurenčním boji. FDA stála na straně Gileadu, odborníci v biostatistice naopak tvrdili, že analytické metody nemohou být průmyslovým tajemstvím. Soud rozhodl v neprospěch firmy. Solidní analýza, jak uzavírá Harris, vyžaduje vždy transparentnost, jakmile ta chybí, otvírá se obrovský prostor pro špatnou vědu.

Další dvě kapitoly Harrisovy knihy, jimž se budu věnovat v příštím článku, se zabývají právě transparentností („Show your work“ = „Ukaž svou práci“) a pak kulturním nastavením současné biomedicíny, které vede k její dalekosáhlé krizi („A Broken Culture“ = „Rozbitá kultura“).

 

Můj první článek o knize Rigor Mortis: https://blisty.cz/art/91569-rigor-mortis.html

A druhý článek: https://blisty.cz/art/92679-rigor-mortis-problem-zvirecich-modelu.html